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MHC 四聚体染色(MHC Tetramer Stain)操作流程

一、MHC四聚体染色基本操作流程

(一)所需主要试剂和设备

(1)欲检测的细胞或全血;

(2)荧光染料标记Anti-CD8抗体或其它抗体;

(3)离心机、流式细胞分选仪等。

(二)基本操作流程

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细胞准备

1)外周血单核细胞、脾细胞、淋巴细胞、常规细胞系细胞等,以2-5×107/ml的密度重悬于FACS BufferPBS+ 2%小牛血清+0.1%叠氮钠;建议使用时新鲜配制),制备成细胞悬浮液。

2)25ul细胞悬浮液滴加入微孔培养板或FACS试管。

Staining Cocktail制备

3)制备2X Staining CocktailFACS Buffer+ MHC四聚体(建议稀释比例为1:501:100+ Anti-CD8/FITC抗体或其他用作内参的抗体(请参考其说明书进行稀释)。

染色孵育

4)25ul 2X Staining Cocktail,滴加入步骤2中的微孔培养板或FACS试管,与细胞悬浮液混匀。(注意:使用移液器轻柔上下吹打混匀,尽可能避免产生气泡。)

5)在冰上或其他已通过实验优化确认的最佳温度条件下,避光孵育60 分钟。

洗涤

6)加入150ul FACS Buffer至微孔培养板每孔或2-3ml FACS BufferFACS试管,轻柔混匀,避免形成气泡,1200 rpm离心5 min,小心除去上清液,尽可能不要触碰到细胞沉淀,减少细胞损失。(注意:对于具有传染性或危害性的样本,可考虑使用吸引器,轻柔吸掉上清液,尽可能不要触碰到细胞沉淀,减少细胞损失。)

7)重复步骤6,再洗涤2次。

细胞固定&流式分析

8)将细胞重悬于200ul固定液(PBS+1%多聚甲醛(PFA))中,使用流式细胞仪进行样本分析。

二、MHC四聚体染色注意事项

(1)染色体系的体积应尽可能小,以节约试剂。例如:25ul 2X Staining Cocktail + 25ul细胞悬浮液=50ul

2)所有操作应尽量在4条件下进行。一些MHC四聚体在室温或更高温度条件下,能获得更高强度的亲和力,可提高染色效果。但另一些细胞表面标志物,比如CD62L,对较高的温度条件往往比较敏感。部分MHC四聚体已被证实,在37条件下容易与细胞解离。故我们建议:在4条件下孵育45-60分钟,或在室温条件下孵育30分钟。

(3)在进行大规模试验前,建议先进行预试验,以确定最佳的MHC四聚体稀释比例。通常,建议MHC四聚体的初始稀释比例为1:1001:200。请根据具体实验,优化其稀释比例,以期获得最佳的染色效果。

(4)对于新鲜的外周血单核细胞、淋巴细胞、脾细胞,通常建议每个染色样品细胞总数为1-2 ×106;而对于细胞克隆或者CTL细胞系,每个样品细胞总数可减低为2×105。当针对细胞克隆染色时,建议选取具有不同特异性的其它克隆细胞作为阴性对照。


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